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4008-369-963
4008-369-963转4
kuer@kuerhuaxue.com
G418
原理及筛选方法
原理
分析转化的功能和表达需要
DNA
稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后,
部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多
80%
的进入核内的外源
DNA
得到
瞬时表达。极少数情况下,进入细胞的外源
DNA
通过系列非同源性分子间重组核连接,最
终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达,
所以整合并不一定意味着表达,
只有整合
到表达区的基因才会表达,而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同
的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件,通常根据新表型筛选稳定转染体。一般
情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌
Tn5
转座子序列
(
neo
抗性基
因)携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将
G418
转变成无毒形式。
G418
是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,它通过影
响
80S
核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、
植物和哺乳动物细胞,
也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当
neo
基因
被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动
neo
基因编码的序列转录为
mRNA
,从
而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,
使细胞获得抗性而能在含有
G418
的选择
性培养基中生长。
G418
的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因
动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上
G418
有杀菌作
用,所以有人主张转染时不加其它抗生素。其实
G418
本身有很好的杀菌效果,在用
G418
进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点,其实我觉得问题也不是很大,那就是:
在老
外的一本实验手册中提到,
在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想
法可能是脂质体对细胞膜有影响,
可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、
链霉
素、
G418
均是氨基糖甙类药物,其药理作用完全一样。所以没有必要再用,而且由于另外
抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度,剂量有误差,不利于各实验室之间的交流,
在实际操作中,培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。
有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好,
但这种观点是很多年以前的观点
了,而且只是少数人的观点。我两种方法都用过,但没有特异的比较过,感觉都可以。磷酸
钙便宜,但对溶液配置和实验操作要求很高,尤其是溶液的
pH
值,要求精确到小数点后
2
位。
脂质体是现在主流的转染试剂,
从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。
非脂质体是
这几年发展很快的技术,转染效率低,细胞毒性小,价格也不贵,
Qiagen
就有一个系列。
我个人觉得不必要花太多时间在这方面,
自己实验室用得好的技术可以坚持,
没有经验的可
以选择一个较著名的公司的产品开始,
购买之前先下载个说明书看看。
有精力就比较一下几
种方法,一般的达到目的就行了。关键是实验设计。
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主要参考《细胞培养和分子细胞学技术》和《分子
克隆》
G418
筛选实验设计
筛选之前
由于每种细胞对
G418
的敏感性不同,
一般变动在
100ug/ml~1000ug/ml
范围。
而且不同
的厂家生产的相同浓度的
G418
的活性不尽相同,所以在筛选之前,一定要确定你的细胞对
这一批
G418
的最佳筛选浓度。
尽管如此,
特性明确的细胞系
G418
的最佳用量还是稳定的。
《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需
G418
的最佳用量。
细胞系或机体
G418
浓度(
ug/ml
)
中国仓鼠卵巢细胞
700~800
Madin-Darby
犬肾细胞
500
G418
原理及筛选方法
原理
分析转化的功能和表达需要
DNA
稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后,
部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多
80%
的进入核内的外源
DNA
得到
瞬时表达。极少数情况下,进入细胞的外源
DNA
通过系列非同源性分子间重组核连接,最
终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达,
所以整合并不一定意味着表达,
只